Disección Molecular y Funcional de los Canales para el Transporte de Proteínas en Mitocondrias Mediante Aproximaciones Electrofisiológicas
Cerca de la mitad de las proteínas de una célula han de cruzar al menos una membrana antes de alcanzar su destino final en la misma. El transporte de proteínas a través de membranas resulta pues un proceso determinante para funciones celulares tan relevantes como la señalización celular, biogénesis de orgánulos, compartimentación o apoptosis. El transporte de precursores proteicos a las mitocondrias es un sistema modelo integrado por complejos proteicos en la membrana externa (translocasa TOM) y en la interna (translocasas TIM23 y TIM22). Como parte integral de los mismos se encuentran canales acuosos. El principal objetivo de esta propuesta es definir la arquitectura, mecanismo de acción y regulación de estos canales durante el transporte de proteínas en mitocondrias de levaduras, aprovechando la versatilidad de manipulación genética que ofrecen estas células. Se aplicarán técnicas de patch-clamp a membranas nativas externas (mitocondrias) e internas (mitoplastos ) de numerosas cepas de levaduras genéticamente modificadas. Las actividades de canal registradas se compararán con las de liposomas conteniendo proteínas que poseen una función relevante en este proceso. Los objetivos específicos relacionados con éste más general son: 1) Demostrar que además de Tim23p, la proteína Tim17p también forma parte del canal de la translocasa TIM23, para lo que el comportamiento de canal y la regulación por péptidos señal de Tim23p recombinante, así como de Tim17p y Tim50p se compararán con el de mitoplastos y proteoliposomas. 2) Demostrar la existencia en mitoplastos del canal de la tranlocasa TIM22 y determinar sus propiedades individuales, regulación y composición. 3) Estudiar la arquitectura, las propiedades individuales y la regulación por péptidos señal del canal de la translocasa TOM. 4) Examinar el proceso de transporte de proteínas a través de las respectivas translocasas, mediante la aplicación de patch-clamp a mitocondrias y mitoplastos genéticamente manipulados. Para ello, se evaluarán la arquitectura de los complejos y el efecto del plegamiento de las preproteínas en el proceso de transporte, utilizando también mutantes y proteínas modelo.
Mientras que las investigaciones propuestas nos permitirán estudiar los mecanismos y determinar la arquitectura y el papel de los canales en el transporte de proteínas a mitocondrias, es muy posible que los mismos principios sean de aplicación a otras membranas biológicas como las del retículo endoplásmico o los cloroplastos. Es de resaltar que la capacidad de aplicar el patch-clamp a mitocondrias e identificar sus canales, mediante procedimientos establecidos en nuestro laboratorio, está haciendo avanzar las investigaciones sobre el papel de las mitocondrias en áreas tan diversas como la liberación de neurotransmisores y las enfermedades neurodegenerativas, el aprendizaje, la muerte celular programada o las infecciones virales.
Organismo Financiador: JUNTA DE EXTREMADURA
Tipo:
Proyecto
Investigadores participantes:
[Calzas Prados, Julián ]
[Campo Guinea, Mª Luisa ]
[Roy Pérez, Teresa de Jesús ]
[Veras Peixoto, Pablo M. ]